RIPA裂解液(中)
● 產(chǎn)品包裝：
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產(chǎn)品編號(hào)
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產(chǎn)品名稱
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產(chǎn)品包裝
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說明書
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RL0130
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RIPA裂解液(中)
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100 ml
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1份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
RIPA裂解液(RIPA Lysis
Buffer)是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多種，根據(jù)其裂解液的強(qiáng)度大致可以分為強(qiáng)、中、弱三類。RIPA裂解液(中)的主要成分為Tris
(pH 7.4)， NaCl， 1% NP-40， 0.5%
sodium deoxycholate， 0.1%
SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑，可以有效抑制蛋白降解。用RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測(cè)定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。
● 保存條件：
-20℃保存，一年有效。
● 注意事項(xiàng)：
1.為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復(fù)凍融?？梢赃m當(dāng)分裝后使用。需自備PMSF。裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
2. RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)與基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。
● 使用說明：
1. 準(zhǔn)備RIPA裂解液：
融解RIPA裂解液，混勻；取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM。
2. 細(xì)胞蛋白提?。?/span>
2.1 貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，加入適量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動(dòng)貼壁細(xì)胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，冰上裂解細(xì)胞5分鐘，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中，冰上繼續(xù)裂解15分鐘，間歇混勻。
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培養(yǎng)板規(guī)格/培養(yǎng)皿表面積
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細(xì)胞量
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RIPA推薦使用量
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100 mm培養(yǎng)皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養(yǎng)皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養(yǎng)皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔板
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔板
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5×105
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100-150 μl
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96孔板
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細(xì)胞：450 g
4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；用適量1×PBS重懸細(xì)胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；重復(fù)漂洗細(xì)胞一次；按照細(xì)胞沉淀體積（PCV）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混勻細(xì)胞沉淀，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
2.3 裂解細(xì)胞：
裂解混合物超聲波處理（超聲條件根據(jù)儀器調(diào)整，建議條件為）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號(hào)：PE2719 ，蛋白提取針頭套裝），以徹底裂解細(xì)胞。冰浴處理15分鐘。
注：裂解中細(xì)胞會(huì)釋放出變性的核酸，呈團(tuán)狀粘稠透明樣，如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導(dǎo)致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和純度。
2.4 離心收集上清：
充分裂解后，4℃ 16000
g離心10分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
3. 組織樣品蛋白提?。?/span>
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，洗凈組織血跡，用濾紙吸
干組織表面液體，將組織切成細(xì)小的碎片。
3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次，收集勻漿后的裂解混合物，超聲波處理（超聲條件根據(jù)儀器調(diào)整，建議條件為）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號(hào)：PE2719 ，蛋白提取針頭套裝），以徹底裂解細(xì)胞。裂解物冰浴處理15分鐘。
注：裂解中細(xì)胞會(huì)釋放出變性的核酸，呈團(tuán)狀粘稠透明樣，如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導(dǎo)致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和純度。
3.4 充分裂解后，4℃ 16000
g離心10分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
實(shí)驗(yàn)示例：
Jurkat RIPA總蛋白提取，GAPDH檢測(cè)
總蛋白提?。?×106 Jurkat細(xì)胞，450 g 離心收集，去上清，PBS漂洗兩次，沉淀中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分鐘，4℃ 16000 g 15 分鐘，上清即為總蛋白（TP）。
電泳：RTD6132-15%3.3C 200 V 33-12 mA 55 min
轉(zhuǎn)膜：NC膜，1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液濕轉(zhuǎn)，穩(wěn)流400 mA，電壓變化64-57 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間35 min
封閉：無(wú)蛋白快速封閉液，RT 20 min
一抗孵育：GAPDH 羊抗兔多抗，一抗稀釋液稀釋1：2000
二抗孵育：羊抗兔IgG-HRP，二抗稀釋液稀釋1：5000
檢測(cè)：ECL發(fā)光檢測(cè)
